描述
circRNAs（Circular RNAs，环形RNA分子）是一类不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。大部分的环状RNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。由于环状RNA对核酸酶不敏感，所以比线性RNA更为稳定，这使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。
CircRNA的种类按其来源可以归类为以下四种：
1.全外显子型的circRNA；
2.内含子和外显子组合的EICircRNA；
3.内含子组成的套索型ciRNA；
4.由病毒RNA基因组、tRNA、rRNA、snRNA等环化产生的circRN。
技术优势
（1）circRNAs由于是封闭环状结构，所以没有5-3’的极性，也没有polyA尾巴。因此，比线性RNA稳定，不容易被RNA核酸外切酶或者RNase R降解。在健康人的唾液细胞里发现了400种以上的circRNAs。
（2）circRNAs表达丰度差异大，在某些情况下，环状分子是其对应线性mRNA表达丰度的10倍以上。
（3）circRNAs大部分有外显子组成，主要存在于细胞质中，可能有miRNA结合的原件（MREs）。一些含有保留内含子区域的circRNA定位在真核生物的细胞核，可能调控了基因的表达。
（4）circRNAs通常是组织特异性和发育不同阶段特异性的。比如，has_circRNA_2149 只在CD19+白细胞而不是CD34+白细胞、中性粒细胞或者HEK293中表达。一些线虫circRNAs在卵母细胞中表达，在1-或者2-细胞胚胎中不表达。
（5）绝大部分的circRNAs是内源非编码RNAs，只有一小部分是外源的circRNAs，如HDV，含有核糖体进入位点（IRESs）的人工circRNAs。
（6）不同物种间的circRNAs大部分是进化保守的，也有部分是进化不保守的。
总的来说，circRNAs的这些特性决定了它们在转录和转录后的重要作用，也暗示着其可能作为疾病诊断的理想biomarker。
技术路线
先讲miRNA→再讲mRNA→最后circRNA→细胞模型+大鼠模型→IVDD
Step1：选择细胞模型和动物模型
发现临床问题后，确定细胞和动物模型，在细胞、动物模型中来建立临床问题和科学假说的直接联系。
可以取组织或者器官最丰富或者最重要的细胞系或者原代细胞，进行传代培养。
Step 2：先从哪个分子着手呢？miRNA！
先从miRNA入手吧，上可找circ，下可寻mRNA。
测序简单，快速，而且成本低
那接下来就是一顿围绕miRNA的操作了：
Q-PCR、Northernblot：在病人的组织样本中验证一下表达量；以及细胞相关实验
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Step 3：mRNA！
可以选择先讲下游的调控机制：miRNA的下游靶基因
上面说到，正常细胞转染mimics后出现了凋亡。
使用miRNA靶基因预测神器：Starbase
①预测的基因→DAVID的GO和KEGG→凋亡信号通路相关的mRNA若干→凋亡基因。
②miRNA调控靶基因mRNA的表达验证：可以通过荧光素酶报告检测验证结合位点突变miRNA同mRNA靶向互作和细胞相关实验。
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Step 4：CircRNA！
怎么预测miRNA的上游circRNA呢？还是神器Starbase！
又是一顿互作的操作和表型检测
①证明该circRNA确实存在，且和其他转录本区分开：PCR、样本验证、FISH定位
②cricRNA的敲减和过表达：miRNA、mRNA的表达量以及细胞凋亡检测
③证明该circRNA和miRNA互作：CLIP sequence、RIP、pulldown、FISH定位
CLIP测序:检测circRNA中有几个miRNA的结合位点！
RIP实验：评估circRNA和miRNA互作深度
Step 5：大鼠体内验证circRNA的功能
构建动物模型，病理切片
好了，以上就是circRNA研究路线和涉及的实验方法！
Step 6：最后不要忘记假说机制图
研究内容
（1）circRNAs由于是封闭环状结构，所以没有5-3’的极性，也没有polyA尾巴。因此，比线性RNA稳定，不容易被RNA核酸外切酶或者RNase R降解。在健康人的唾液细胞里发现了400种以上的circRNAs。
（2）circRNAs表达丰度差异大，在某些情况下，环状分子是其对应线性mRNA表达丰度的10倍以上。
（3）circRNAs大部分有外显子组成，主要存在于细胞质中，可能有miRNA结合的原件（MREs）。一些含有保留内含子区域的circRNA定位在真核生物的细胞核，可能调控了基因的表达。
（4）circRNAs通常是组织特异性和发育不同阶段特异性的。比如，has_circRNA_2149 只在CD19+白细胞而不是CD34+白细胞、中性粒细胞或者HEK293中表达。一些线虫circRNAs在卵母细胞中表达，在1-或者2-细胞胚胎中不表达。
（5）绝大部分的circRNAs是内源非编码RNAs，只有一小部分是外源的circRNAs，如HDV，含有核糖体进入位点（IRESs）的人工circRNAs。
（6）不同物种间的circRNAs大部分是进化保守的，也有部分是进化不保守的。
总的来说，circRNAs的这些特性决定了它们在转录和转录后的重要作用，也暗示着其可能作为疾病诊断的理想biomarker。
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