描述
RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RNA结合蛋白免疫沉淀)是研究体内 RNA 与蛋白结合情况的技术,主要包括RIP-qPCR和RIP-seq两种;其中RIP-qPCR用来验证与目标蛋白结合的已知RNA,RIP-seq用来筛选与目标蛋白结合的未知RNA。
技术优势
细胞裂解后,孵育结合了抗体的珠子,诱饵蛋白通过其抗体结合到Beads上,同时和诱饵蛋白互作的RNA,也一起沉淀到Beads上。洗涤掉未结合的RNA后,再用洗脱液将RNA-蛋白复合物从Beads洗脱下来,便得到RNA免疫沉淀产物。RIP产物既可用qPCR检测已知RNA,也可以二代测序检测未知RNA。
当没有合适的诱饵蛋白抗体时,可以通过表达融合了flag标签的诱饵蛋白,利用flag标签做免疫沉淀。即细胞过表达Flag-Bait,经裂解后与anti-Flag珠子孵育,诱饵融合蛋白与Beads结合,与诱饵融合蛋白互作的RNA“共沉淀”到Beads上,再经洗涤、洗脱后做qPCR或NGS测序。
技术路线
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研究内容
RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)是一类功能强大而广泛的调节因子,约占细胞编码的所有蛋白的5%~10%。目前除了少数RNA以核酶形式单独发挥功能,大部分RNA通过与蛋白结合形成RNA-蛋白复合物来发挥作用。
一方面,RBP参与RNA合成、可变剪接、修饰、转运、翻译及胞内定位等多个转录后调控过程,调控mRNA稳定性、lncRNA活性、miRNA沉默复合体形成等生物学过程;另一方面,RNA也会调节这些蛋白质的活性、定位或与其他蛋白质的相互作用,从而影响RBP介导的各种细胞事件。RNA与蛋白质的相互作用对于维持细胞稳态是非常重要的,干扰这种相互作用将会导致细胞功能失调和相关疾病的发生。
目前研究RNA-蛋白质相互作用的方法分为两大类:一是以感兴趣的RNA为中心,寻找与该RNA结合的蛋白质;二是以感兴趣的蛋白质为中心,寻找与该蛋白质结合的RNA。RIP(RNA免疫共沉淀)属于后者,利用特异性的抗体捕获样本中的目标蛋白,那么与目标蛋白结合的RNA也一并被捕获,之后通过qPCR或者测序技术来确定这些结合的RNA。
信息分析内容
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